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老师您好 我想咨询....
老师您好 我想咨询下细菌、大肠杆菌的检查方法是....？我们公司请的老师教的操作让人有所质疑，所以...拜托老师您了
咨询者：林孝铭 咨询时间：2007-06-13 状态：已回复
专家 李玉成 解答表达感谢 继续咨询该问题 参与讨论-
提供参考:饮用水中大肠杆菌快速检测方法
【申请(专利)号】 CN200410022322.2 【专利申请日】 2004-04-14
【公开(公告)号】 CN1563422 【公开(公告)日】 2005-01-12
【主分类号】 C12Q1/68 【分类号】 C12Q1/68;C12Q1/04
【颁证日】 0000-00-00 【优先权】
【申请(专利权)人】 重庆大学 【地址】 400045重庆市沙坪坝区重庆大学生城市建设与工程学院
【发明(设计)人】 龙腾锐;马颖;方振东;周从直 【国际申请】
【国际公布】 【进入国家日期】 0000-00-00
【专利代理机构】 重庆华科专利事务所 【代理人】 康海燕
【摘要】
本发明涉及一种饮用水大肠杆菌的快速检测方法。应用分子生物学中的聚合酶链式反应，用PCR方法检测大肠杆菌，包括以下几个步骤：水样中微生物的收集、微生物基因组DNA的提取、PCR扩增、产物观察。采用上述方法与传统方法相比，时间短，从水样送到实验室开始到检测完毕，大约需要4～5个小时；灵敏度高，可以检测到1～10个大肠杆菌/mL水样。而传统检测方法至少需要48h。
【主权项】
1、饮用水中大肠杆菌快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)水样中微生物的收集及其DNA的提取：采用灭菌后的滤膜或滤器过滤水样，在装有无菌水的EP管中，洗涤滤膜，离心，弃上清液，备用；(2)水样中微生物DNA的提取：A、向EP管中加入TE缓冲液，使之重悬；B、加入SDS和蛋白酶K，混匀，温育45min～1h；C、加入氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；D、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；E、加入异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；F、弃上清，沉淀物用乙醇洗涤，晾干；G、将沉淀重溶于TE缓冲液，摇匀；H、用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的0D值，计算其DNA浓度，计算方法为：DNA浓度(μg/μL)＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000I、将基因组DNA模板做好标记，贮存，备用；(3)PCR扩增；反应引物：上游引物：5’-tgttcagtggcaagagtt-3’下游引物：5’-taatcgatatacccgctc-3’50μL反应体系：10×PCR缓冲液5μLTag酶2U/μL1μLMgCl2(25mM)5μLdNTP(2.5MM)5μLddH2029μL上游引物10μM2μL上游引物10μM2μL模板DNA1.5μg/μL1μL(4)产物观察：A、凝胶的准备：先配置琼脂糖溶液，加热，使其充分溶解，再加入溴化乙锭溶液；B、配置TAE电泳液；C、倒胶：将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中；D、电泳：将扩增好的PCR产物与缓冲液按比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。E、观察；将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。
李玉成
回复：李玉成 回复时间：2007-06-17
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